Для поиска темы - пользуйтесь СИСТЕМОЙ ПОИСКА


Стоимость дипломной работы


Home Материалы для работы Биотехнологическое формирование генотипов свиней

Биотехнологическое формирование генотипов свиней
загрузка...
Рейтинг пользователей: / 0
ХудшийЛучший 

Биотехнологическое формирование генотипов свиней.

Свинья многоплодна и обладает способностью относительно бы-стро достигать репродуктивной и мясной зрелости. Минимальный ин-тервал между поколениями составляет 14 месяцев, но практически он колеблется от 2,5 до 3,0 лет. Оптимальным этот показатель будет при наличии высокодостоверных методов оценки генотипа животного по его собственным параметрам интерьера. В настоящее время скорость селекционного процесса ограничивается степенью точности оценки потенций свиней на ранних стадиях онтогенеза. Решение данной про-блемы, судя по достижениям генетики, находится в области молеку-лярной биологии, иммуногенетических и популяционных исследований, широко использующихся в регулировании микро- и макроэволюционных процессов. В частности, откормочные и мясные признаки оп-ределяют по уровню аминотрансфераз в крови 2-6-месячных свиней, имеющих коэффициент наследуемости 0,5 [29]. Сообщается о созда-нии стад с имплантированным геном соматолиберина, метаболизм у которого круто смещен с жировой в белковую сторону [30]. Получены свиньи с интегрированным геном рилизинг-фактора гормона роста, ко-торые характеризуются повышенными темпами роста в более поздних стадиях развития и большим содержанием белка в туше [31]. Но путь к биотехнологической селекции, разработке ее теоретических положе-ний, судя по темпам продвижения науки, будет сложным [32]. Поэто-му на данном этапе методы классической селекции в сочетании с приемами иммуно- и цитогенетики, ДНК-технологий [33], популяцион-ной генетики на базе ЭВМ [34, 35] являются основой формирования желательных генотипов. При этом существенным фактором является усовершенствование аналитической и методической базы прижизнен-ного определения количественных параметров селекционируемых при-знаков. Когда пренебрегают данным условием, полагаясь на интуицию талантливых бонитеров, замедляются процессы племенной работы, теряется оптимальность производства свинины [36].Повышение раз-решающей способности современных средств вычислительной техни-ки является важным условием применения генетико-математического аппарата [37-41] при определении параметров селекционируемых при-знаков, моделировании с прогнозом эффективности процессов отбора, подбора, взаимодействия “генотип-среда” [42-47].
В отношении создания трансгенных свиней следует учитывать следующие положения. Усовершенствование методологии молекуляр-ной генетики обеспечило получение в необходимых количествах ДНК как носителя наследственной информации [48].Данные методы откры-вают принципиально новые перспективы работы на генном уровне. Выделение определенных генов, их секвенирование, рекомбинация и перенос (транспорт) с одного в другой геном. Эти технологии, по обоснованным прогнозам [49-53], в недалеком будущем будут суще-ственно дополнять традиционные методы селекции животных, в том числе свиней. Перенос in vitro целевых генов в ДНК реципиентов осу-ществляется для формирования трансгенных образований, которые обеспечивают получение трансгенного продукта-протеина. Последний характеризует новые свойства реципиентов, которые, в случае насле-дования потомками, позволяют консолидировать устойчивые селекци-онные образования (линии, семейства, популяции). Единообразие строения двойной цепи ДНК и универсальность генетического кода в генных конструкциях позволяют использовать рекомбинантную ДНК от разных донорских организмов. При этом следует учитывать, что при экспрессии встроенного гена могут проявляться новые взаимодей-ствия, обусловленные происхождением ДНК донора и реципиента. При формировании трансгенных организмов стремятся, чтобы трансген содержался во всех соматических и, в первую очередь, эмбриональ-ных клетках животного. На данном этапе такой эффект достигается переносом генов на самых ранних стадиях развития организма. Опти-мальным временем является раннее эмбриональное развитие, то есть фаза, на которой организм существует в виде одной клетки (зиготы). Некоторые методы транспорта генов требуют использования более поздних эмбриональных стадий - морулы или бластоцисты. В настоя-щее время наиболее разработанными методами транспорта генов яв-ляются микроиньекция ДНК в пронуклеус зигот, транспорт ДНК с ис-пользованием ретровирусных векторов, получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов [54]. В прин-ципе любая молекула ДНК может быть перенесена в геном свиньи путем микроиньекции. Частота интеграции генных конструкций мик-роиньекцией зависит от строгого соблюдения апробированной методи-ки. По данным профессора, доктора Г.Брема из Венского Ветеринар-но-медицинского университета (Австрия), для получения одного трансгенного поросенка необходимо задействовать 20 полновозраст-ных свиней [9]. Для установления факта интеграции трансгена исполь-зуются специальные методики (Southern-блот анализ, дот-блот анализ, полимеразная цепная реакция - РСR). Хромосомную локализацию ин-тегрировавшейся последовательности ДНК определяют путем гибри-дизации метафазных хромосом in situ. Важным вопросом в процессе получения трансгенных свиней является определение характера на-следования трансгена. Данные процессы досконально еще не изучены. Установлены явления генетического мозаицизма, то есть получение животных, несущих две или более клеточные линии, происходящие из одной зиготы, но имеющие различный генотип. Трансгенные мозаики помимо клеток с трансгеном включают также нетрансгенные клеточ-ные линии. Если клетки гонад животного не содержат трансген, его потомство не будет наследовать иньецированный ген от трансгенного родителя, следовательно, мозаицизм обусловит невозможность фор-мирования трансгенных линий. Такие животные имеют ограниченную ценность. У свиней с интеграцией трансгена во всех клетках организ-ма при стойкой передаче его потомству характер наследования соот-ветствует менделевским законам. В основном интеграция реализует-ся только в одной точке одной хромосомы и эти животные являются гемизиготными. Мозаицизм трансгенных свиней наблюдается только в поколении F0 , а животные F1 и последующих генераций имеют ген-ную конструкцию во всех соматических и генеративных клетках, хотя наблюдались случаи нестойкой интеграции и потери трансгена в про-цессе передачи его от поколения к поколению. Для эффективного ис-пользования трансгенных линий в практике разведения необходимы стабильная передача трансгена потомству, возможность получения трансгенных особей, стабильная экспрессия трансгена с его положи-тельным биологическим влиянием на заданные свойства. Для гаран-тированного создания трансгенной линии необходимо иметь минимум 5-10 первичных трансгенных животных [9]. По данным академика РАСХН Л.К. Эрнста, имеются реальные успехи в получении транс-генных свиней. При этом акцентируется внимание на необходимости центрифугирования зигот для визуализации. В условиях in vitro до ста-дии морулы - бластоцисты развивается около 50% центрифугирован-ных, не инъецированных зигот. После инъекции ДНК последующие эмбриональные стадии проходят 10-20% зигот, из них 5,6 11,6% закан-чиваются рождением поросят [54]. Степень интеграции у свиней со-ставляет до 10%, у двух из пяти трансгенных свиней установлено на-следование трансгена в потомстве [9,54]. В отдельных экспериментах получены положительные результаты переноса чужеродных генов свиньям с помощью ретровирусных векторов [55], оплодотворением яйцеклеток in vitro, обработанными ДНК спермиями [56]. Результа-тивность переноса генов обусловливается качеством пересадки эм-брионов, мастерством при манипулированиях с эмбрионами, видом и продолжительностью их культивирования in vitro, формой и концентра-цией ДНК, синхронизацией доноров и реципиентов, временем пересад-ки и возрастом используемых животных. Ввиду благоприятных осо-бенностей репродукционно- биологических параметров свиней, они представляют большой интерес для трансгенеза. Предпочтение отда-ется взрослым исходным особям (донорам и реципиентам). Одновре-менная пересадка немикроиньецированных и инъецированных зигот повышает выживаемость последних [57 59]. Особенностью свиней является возможность одновременного использования доноров эм-брионов в качестве реципиентов. У свиней возможно получение гомо-зиготных трансгенных линий [9].
На данном этапе исследования в области трансгенеза свиней сконцентрированы на ускорение роста животных, качественных пара-метрах мяса, повышении резистентности организма. Для ускорения данного процесса необходимо совершенствование методов выделения, характеристики и переноса генов, модификации генома животных. При этом большое значение имеют выделение и характеристика соответ-ствующих регуляторных элементов. Это обусловлено тем, что струк-турные гены сами по себе не функционируют без особых генных кон-структоров - промоторов, энхансеров, обеспечивающих экспрессию структурных генов. Следовательно, существенное значение имеет по-лучение генных конструкций, позволяющих вызвать экспрессию ин-тегрированных генетических структур в конкретной ткани, в нужное время и с желаемой интенсивностью [54]. При интеграции в геном свиньи генной конструкции, экспрессирующей определенный компо-нент, выполняющий важную функцию в обмене веществ, возникает необходимость получения объективных данных всего многообразного спектра воздействия данного нового фактора на все многообразие морфологических, физиологических и биохимических признаков в ор-ганизме. Поэтому стоит проблема не нарушить целостность организ-ма, установившиеся корреляции в эволюционном процессе, или обес-печить гармонизацию на новом уровне. Данные вопросы решаются при формировании быстрорастущих свиней, трансгенных по гормону роста.
Гормон представляет полипептид, образуемый передней долей гипофиза (GH), влияющий на белковый обмен и стимулирующий рост скелета. Аналогичное действие оказывает соматомедин или релизинг-фактор гормона роста (GHRF). Активность этого гормона зависит от концентрации GHRF и SRIF - соматостатина, а также от возраста жи-вотного, и подвержена суточным колебаниям. Гормон попадает в ор-ганы через кровеносную систему и связывается с клетками через специальные рецепторы, в основном аккумулируясь в печени, жировой ткани, мышцах, почках, сердце [60]. Установлено, что интеграция и экспрессия гормона роста крупного рогатого скота обеспечивали по-вышение скорости роста трансгенных свиней на 23% по сравнению с контрольными аналогами, при лучшем усвоении корма на 18% и меньшей толщине шпика [61]. В ряде случаев наблюдалась экспрес-сия трансгенов без фенотипического эффекта. Так, экспрессия гормо-на роста человека у поросят не изменила их скорости роста [62]. По этому факту есть предположения отсутствия специфического феноти-пического эффекта у животных со слабым узнаванием его рецептора-ми молекул чужеродного гормона или посттрансляционными модифи-кациями белка [63]. Видимо, окончательно причины не выяснены. Ус-тановлено, что нерегулируемая экспрессия гена гормона роста, приво-дит к сокращению продолжительности жизни трансгенных животных по причинам патологических нарушений обмена веществ, развития ак-ромегалии и неустойчивости к инфекционным заболеваниям. Транс-генные свиньи с гиперфункцией гормона роста страдали от неблаго-приятных побочных эффектов, были меньше по живой массе при рож-дении, чем одно-пометные аналоги, более вялые, с угнетенным аппе-титом, склонностью к артритам, с продолжительностью жизни, не пре-вышавшей одного года. Постоянная экспрессия гормона роста у трансгенных животных сначала приводила к снижению плодовитости, а затем к стерильности. Поэтому стало ясно, что хронически высокий, нерегулируемый уровень гормона роста негативно влияет на их про-дуктивность. Для умеренной экспрессии гена гормона роста получены трансгенные животные с интеграцией модифицированных генов, коди-рующих рилизинг-фактор гормона роста, у которых наблюдался толь-ко повышенный уровень рилизинг-фактора. Животные нормально раз-вивались, были здоровыми, но не росли быстрее [64]. Таким образом, воздействие на один гормон комплексного гормоноростового каскада не будет эффективным до тех пор, пока не будут созданы сложные конструкции генов с тонкой регуляцией процессов метаболизма. Оп-ределенные успехи в этом направлении имеются [65-69].
Найдены подходы к использованию факторов, отвечающих за дифференцировку и развитие тканей. Примером может служить вве-дение свиньям гена ski птицы. При экспрессии ski у трансгенных по этому гену свиней в мышцах проявлялось большое количество фено-типических изменений, включая мышечную гипертрофию. В отноше-нии использования организма свиней для производства специфических веществ, в частности, фармакологического действия, также имеются успехи. Сформированы животные (n = 10) с 9% содержанием в крови гемоглобина человека с чистотой 99%. Налаживается промышленное производство (фирма DNX, Принстон, Нью-Джерси, США). Данный препарат обладает свойством длительного хранения, лишен эритроци-тов, поэтому нет необходимости определять группы крови. Например, если учесть, что в США ежегодно используют 70 млн. единиц депони-рованной крови человека стоимостью 10 млрд. долларов, эффектив-ность разработки очевидна [70].В Германии получена трансгенная свинья, продуцирующая в слюнной жидкости гормон роста человека [54], данное направление считается весьма перспективным.
Методы генной инженерии применяются для повышения устойчи-вости организма свиней к инфекционным заболеваниям. Трансгенез направлен на активацию формирования иммунокомпетентных Т-клеток, обеспечивающих гуморальный и клеточный иммунитет, на ин-гибирование транскрипции вирусной РНК и синтеза вирусных белков, на выработку белков комплимента - ингибиторов РНК- и ДНК-содержащих вирусов, подавляющих их инфекционную активность, ак-тивирующих фагоцитоз, а также на повышение специфической защиты от вирусов, ингибирование синтеза вирусоспецифических РНК, блоки-рование репродукции вирусов [71-77]. Получены свиньи, трансгенные по гену МХ, который обеспечивает устойчивость их организма к виру-су гриппа [78].
Для решения проблемы генно-инженерного изменения полигенных количественных признаков необходимо формирование политрансген-ных свиней, что чрезвычайно сложно по техническим условиям и по причине невозможности клонировать еще неизвестные гены. К 1989 году было установлено местоположение на хромосоме свиньи 40 генов [79], в то время как общее их количество оценивается в более чем 50 000.С 1991 года эти исследования проводились в ряде стран по согласованной международной европейской программе PIGMAP. В 1996 году собраны и опубликованы данные по 191 структурному гену и 529 некодирующим локусам (микросателиты и др.). Представлены стандартизированные схемы G-исчерченных хромосом гаплоидного кариотипа Sus scrofa domestica, на которых нанесены практически все кодирующие гены и информативные молекулярные маркеры, а также дан полный перечень использованных в сформированной карте аббревиатур генных локусов и приведена их расшифровка [80]. Иссле-дования в этой области продолжаются [81-83], особенно в связи с оп-ределением стрессочувствительности организма свиней [84-86].
По обоснованным прогнозам уже в период 2009-2025 годы дос-тижения нейрологии и генной инженерии позволят формировать и кло-нировать генотипы свиней с весьма широким спектром заданных свойств и качеств.


 
загрузка...

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить